試論不同凍干保護(hù)劑對(duì)利巴韋林凍干粉針的影響論文
在制備凍干粉針劑的過程中，為了保護(hù)藥品的活性，獲得均勻、一致、表面光滑、穩(wěn)定的產(chǎn)品，必須加入起到填充、賦形、穩(wěn)定作用的保護(hù)劑，很多糖類或多元醇經(jīng)常被用于溶液凍融和凍干過程中的穩(wěn)定劑。常用的保護(hù)劑有糖類(如葡萄糖、乳糖等)、多元醇(如甘露醇、山梨醇等)、氨基酸類(如甘氨酸、谷氨酸等)、無機(jī)鹽類(如氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣等)和大分子類(如明膠等)。它們既是有效的低溫保護(hù)劑，又是很好的凍干保護(hù)劑，它們對(duì)凍結(jié)的影響取決于種類和濃度。但在實(shí)際應(yīng)用中，因沒有依據(jù)而廣泛嘗試大量保護(hù)劑種類，并通過大量實(shí)驗(yàn)摸索確定保護(hù)劑品種的凍干參數(shù)是對(duì)資源、時(shí)間的浪費(fèi)。本實(shí)驗(yàn)以利巴韋林為模型藥物，同時(shí)輔以空白組作為對(duì)比，研究蔗糖、無水乳糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、氯化鉀、甘氨酸7 種不同類型常用凍干保護(hù)劑的預(yù)凍時(shí)間、用量、凍干時(shí)間等凍干參數(shù)，并比較其凍干后的外觀和復(fù)溶效果、含水量、pH 值、主藥含量變化等相關(guān)性能，以期對(duì)凍干劑制備時(shí)保護(hù)劑的選擇提供依據(jù)。
1 材料
BX51TRF 型顯微鏡(奧林巴斯株式會(huì)社);BSl10S 型萬分之一電子分析天平、P8-10 型pH 酸度計(jì)(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);DW-86L626 型超低溫保存箱(青島海爾特種電器有限公司);LGJ-12 型冷凍干燥機(jī)(北京松源華興科技發(fā)展有限公司);FD-1C-50 冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);Lyo-0.4 型真空冷凍干燥機(jī)(上海東富龍科技有限公司);HCT 型微機(jī)差熱天平(北京恒久科學(xué)儀器廠);Waters 超高效液相色譜儀：二元溶劑管理系統(tǒng)、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、PDA檢測(cè)器(美國(guó)Waters 公司)。利巴韋林由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。Emprove 低內(nèi)毒素蔗糖(批號(hào)K43921892)、Emprove 低內(nèi)毒素甘露醇(批號(hào)M759903247)、Emprove 低內(nèi)毒素甘氨酸(批號(hào)VP559490329)、Emprove 低內(nèi)毒素山梨醇(批號(hào)M630297337)、Emprove 低內(nèi)毒素氯化鉀(批號(hào)A0519420 )、Emprove 低內(nèi)毒素葡萄糖(批號(hào)K45447546413)均由默克化工技術(shù)(上海)有限公司提供;無水乳糖(上海昌為醫(yī)藥輔料技術(shù)有限公司，批號(hào)1320012820)。
2 方法與結(jié)果
2.1 凍干粉針的制備
2.1.1 利巴韋林凍干粉針的制備按照處方量精密稱取利巴韋林250 mg 以及適量?jī)龈杀Ｗo(hù)劑，用注射用水溶解，定容至10 mL，以0.45μm 微孔濾膜濾過，分裝于5 mL 西林瓶，1 mL/瓶，25 mg/mL。80℃低溫預(yù)凍后放入凍干機(jī)中干燥。
2.1.2 空白凍干粉針的制備按照處方量精密稱取適量?jī)龈杀Ｗo(hù)劑，用注射用水溶解，定容至10 mL，以0.45 μm 微孔濾膜濾過，分裝于5 mL 西林瓶，1mL/瓶，25 mg/mL。80 ℃低溫預(yù)凍后放入凍干機(jī)中干燥。
2.1.3 凍干粉針的外觀和復(fù)溶效果取利巴韋林凍干粉針和空白凍干粉針，凍干保護(hù)劑用量為10%，預(yù)凍15 h，凍干15 h，初步比較不同凍干保護(hù)劑的凍干效果。Emprove 低內(nèi)毒素葡萄糖、山梨醇凍干失敗，原輔料損失;Emprove 低內(nèi)毒素蔗糖和無水乳糖凍干后外觀和復(fù)溶均良好，但放置后逐漸塌陷;Emprove 低內(nèi)毒素甘露醇、甘氨酸、氯化鉀凍干粉針的外觀飽滿平整、復(fù)溶迅速完全。
2.2 預(yù)凍時(shí)間的`考察
取利巴韋林凍干粉針和空白凍干粉針，凍干保護(hù)劑用量為10%，凍干15 h，考察不同凍干保護(hù)劑的適用的最短預(yù)凍時(shí)間。鑒于2.1.3 的結(jié)果，凍干失敗的原因有可能與預(yù)凍不完全有關(guān)，故不同的凍干保護(hù)劑選擇了不同的預(yù)凍時(shí)間水平進(jìn)行考察。依據(jù)降低能耗、節(jié)約能源的原則，在取得同樣效果的前提下，選擇預(yù)凍時(shí)間Emprove 低內(nèi)毒素蔗糖24 h，無水乳糖、Emprove 低內(nèi)毒素甘露醇、Emprove 低內(nèi)毒素甘氨酸和Emprove 低內(nèi)毒素氯化鉀均為9 h，Emprove 低內(nèi)毒素葡萄糖、山梨醇仍然失敗。
2.3 凍干保護(hù)劑用量的考察取利巴韋林凍干粉針和空白凍干粉針，按照2.2的結(jié)果確定不同凍干保護(hù)劑的預(yù)凍時(shí)間，凍干15 h，考察不同凍干保護(hù)劑、不同用量水平適用的最少用量。依據(jù)降低能耗、節(jié)約能源的原則，在取得同樣效果的前提下，選擇Emprove 低內(nèi)毒素蔗糖10%，Emprove 低內(nèi)毒素甘露醇、甘氨酸、氯化鉀和無水乳糖均為4%，Emprove 低內(nèi)毒素葡萄糖、山梨醇仍然失敗。
2.4 凍干時(shí)間的考察取利巴韋林凍干粉針和空白凍干粉針，按照2.2的結(jié)果確定不同凍干保護(hù)劑的預(yù)凍時(shí)間，按照2.3的結(jié)果確定不同凍干保護(hù)劑的用量，考察不同凍干保護(hù)劑的適用的最短凍干時(shí)間。依據(jù)節(jié)約輔料的原則，在取得同樣效果的前提下，選擇Emprove 低內(nèi)毒素蔗糖15 h，Emprove 低內(nèi)毒素甘露醇、甘氨酸、氯化鉀和無水乳糖均為6 h，Emprove低內(nèi)毒素葡萄糖、山梨醇仍然失敗。
2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)
依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定最優(yōu)條件，進(jìn)行 3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表5。所得凍干粉針除Emprove低內(nèi)毒素甘氨酸表面略有裂隙外，其他凍干粉針均外觀飽滿、平整，同時(shí)所有凍干粉針劑均能夠迅速、完全復(fù)溶。
2.6 含水量的測(cè)定
采用庫(kù)侖法測(cè)定含水量。取適量樣品，減重法稱量，加入C30 庫(kù)侖法卡爾費(fèi)休水分儀中，輸入樣品編號(hào)和質(zhì)量后進(jìn)行測(cè)定，最終含水量均為3 批樣品含水量的平均值，結(jié)果見表 6，均符合凍干制劑含水量低于5%的要求。
2.7 pH 值的測(cè)定
取凍干前的樣品溶液 2 mL，將pH 計(jì)探頭插入溶液中，直到pH 計(jì)讀數(shù)不變，此時(shí)的讀數(shù)即為所求pH 值;凍干后的樣品以凍干前相同體積的水復(fù)溶后，取2 mL 用pH 計(jì)測(cè)定pH 值。取實(shí)驗(yàn)所得樣品測(cè)定凍干前后的pH 值，最終pH 值均為3 批樣品的平均值，結(jié)果見表7。凍干后pH 值變化不大，考慮到pH 計(jì)存在一定的測(cè)量誤差，總體認(rèn)為pH 值沒有根本性改變，影響不大。
2.8 利巴韋林凍干粉針中利巴韋林的測(cè)定
2.8.1 色譜條件色譜柱：ACQUITY UPLC HSST3 色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm);流動(dòng)相為純水;體積流量0.25 mL/min;柱溫30 ℃;樣品室溫度4 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)206 nm;進(jìn)樣量1 μL。
2.8.2 對(duì)照品溶液的制備精密稱定利巴韋林對(duì)照品4.01 mg，置10 mL 量瓶中，純水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。
2.8.3 供試品溶液的制備取空白凍干粉針劑和利巴韋林凍干粉針劑各1 瓶，分別用純水溶解，并各自轉(zhuǎn)移至10 mL 量瓶中，純水稀釋至刻度，搖勻，即得。
2.8.4 專屬性試驗(yàn)分別取空白凍干粉、利巴韋林凍干粉和利巴韋林對(duì)照品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，并記錄色譜圖。
2.8.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立精密稱定利巴韋林對(duì)照品10.03 mg，置25 mL 量瓶中，純水溶解并稀釋至刻度，搖勻即得0.40 mg/mL 利巴韋林對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密移取上述儲(chǔ)備液0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mL 置10 mL 量瓶中，純水稀釋至刻度，搖勻即得質(zhì)量濃度分別為12、24、36、48、60、72 μg/mL對(duì)照品溶液。將上述對(duì)照品溶液進(jìn)樣分析，并記錄色譜圖。以峰面積對(duì)質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=2 591.8 X-1 974.1，R2=0.999 7，表明利巴韋林在12～72 μg/mL 與峰面積線性關(guān)系良好。
2.8.6 精密度試驗(yàn)取利巴韋林凍干粉針劑1 瓶，制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，結(jié)果利巴韋林峰面積的RSD 值為1.7%。
2.8.7 重復(fù)性試驗(yàn)取同一批利巴韋林凍干粉針劑6 瓶，制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果利巴韋林質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD 值為2.1%。
2.8.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)吸取利巴韋林凍干粉針劑供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12 h 進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得利巴韋林峰面積的RSD 值為2.2%。結(jié)果表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性較好。
2.8.9 加樣回收試驗(yàn)取已知量的利巴韋林凍干粉針劑供試品共9 份，精密加入一定量利巴韋林對(duì)照品溶液，制備供試品溶液6 份，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果利巴韋林的平均回收率為101.1%，RSD 值為1.7%。
2.8.10 樣品測(cè)定取利巴韋林凍干粉針劑樣品，制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算樣品凍干前和凍干后利巴韋林的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。
3 討論
實(shí)驗(yàn)選擇了 7 種凍干保護(hù)劑進(jìn)行比較研究，其中Emprove 低內(nèi)毒素葡萄糖和Emprove 低內(nèi)毒素山梨醇在不同因素水平下均未能成功制備粉針劑。Emprove 低內(nèi)毒素蔗糖、無水乳糖、Emprove 低內(nèi)毒素氯化鉀、Emprove 低內(nèi)毒素甘露醇、Emprove低內(nèi)毒素甘氨酸均能在適宜條件下制備粉針劑。從節(jié)約能耗的角度考慮，Emprove 低內(nèi)毒素甘露醇、Emprove 低內(nèi)毒素甘氨酸、Emprove 低內(nèi)毒素氯化鉀、無水乳糖4 種保護(hù)劑更為適合選擇，尤以Emprove 低內(nèi)毒素甘露醇為佳。實(shí)驗(yàn)研究了Emprove 低內(nèi)毒素蔗糖、無水乳糖、Emprove 低內(nèi)毒素葡萄糖、Emprove 低內(nèi)毒素甘露醇、Emprove 低內(nèi)毒素山梨醇、Emprove 低內(nèi)毒素氯化鉀、Emprove 低內(nèi)毒素甘氨酸7 種不同類型常用凍干保護(hù)劑作為水溶性藥物利巴韋林凍干保護(hù)劑的性能，確定了一些基本參數(shù)，為水溶性藥物凍干粉針劑的制備提供了參考。
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